Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀探究小鼠咬肌副交感舒血管舒張的相關影響

北海道健康科學大學牙口腔生物學系生理學分部的Takeharu Niioka團隊的研究成果“Involvement of vasoactive intestinal polypeptide in the parasympathetic vasodilatation of the rat masseter muscle"發(fā)表于《Archives of Oral Biology》期刊。該研究聚焦大鼠咬肌，旨在探究三個問題：（1）支配血管的副交感神經是否具有血管活性腸多肽（VIP）免疫反應性；（2）靜脈注射VIP是否會誘導咬肌血管舒張；（3）選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP在有無阿托品存在的情況下，對副交感神經血管舒張的影響。

摘要

已知大鼠咬肌內的血管受副交感神經支配，其血管舒張通過膽堿能和非膽堿能兩種機制實現(xiàn)，但非膽堿能機制尚未明確。近年來，有充分證據(jù)表明血管活性腸多肽（VIP）參與了口面部（如下頜下腺和下唇）的副交感神經血管舒張過程，然而關于其在大鼠咬肌中的作用卻知之甚少。本研究以大鼠咬肌為研究對象，開展了以下探究：（1）支配血管的副交感神經是否具有VIP免疫反應性；（2）靜脈注射VIP是否會誘導血管舒張；（3）選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP在有無阿托品存在時，對副交感神經血管舒張的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在副交感耳神經節(jié)和血管周圍的神經纖維這兩個部位均檢測到了VIP免疫反應性；靜脈注射VIP可誘導咬肌血管舒張，且[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP能減弱VIP注射引發(fā)的血管舒張效應；單獨使用[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP時，無法抑制副交感神經血管舒張，但當[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時，可降低副交感神經血管舒張效應。這些結果表明：（1）支配咬肌血管的節(jié)后副交感神經中存在VIP；（2）靜脈注射VIP可誘導咬肌血管舒張；（3）當毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受抑制時，VIP可能參與咬肌的副交感神經血管舒張調節(jié)。

實驗材料與儀器

（一）實驗材料

1. 動物：成年雄性Wistar大鼠（體重260-640g）

2. 試劑：熒光金、無菌生理鹽水、、烏拉坦、泮庫溴銨、4%多聚甲醛、0.1M磷酸鈉緩沖液（pH7.4）、30%蔗糖、1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100、0.3%牛血清白蛋白、VIP抗體、囊泡乙酰膽堿轉運體抗體、Alexa-488標記的驢抗兔IgG抗體、Alexa-568標記的驢抗山羊IgG抗體、熒光素蓖麻凝集素I、VIP、選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP、阿托品

3. 其他：明膠包被玻片

（二）實驗儀器

Hamilton微量注射器、冷凍切片機、熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡、插管器械

、加熱墊、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

實驗過程

1.動物飼養(yǎng)

實驗大鼠采用12小時光照/12小時黑暗的飼養(yǎng)周期，自由攝食飲水。

2.熒光雙標記法：熒光金逆行運輸結合VIP或VAChT免疫組化

1. 大鼠經腹腔注射麻醉后，在頰部皮膚做小切口暴露咬肌表面，用Hamilton微量注射器向咬肌內垂直注射1μL 2%熒光金，注射速度0.1ml/min，注射后留針2分鐘以防回流。

2. 48-72小時后麻醉大鼠，先以250ml生理鹽水灌注，再用500ml 4%多聚甲醛灌注。

3. 取出耳神經節(jié)（OG），浸泡于含30%蔗糖的冰冷緩沖液中，用冷凍切片機將其切成40μm切片，對所有切片進行VIP和VAChT免疫組化染色。

4. 染色后將切片置于明膠包被玻片上，用熒光顯微鏡觀察FG標記神經元、VIP及VAChT免疫反應性，計數(shù)每個耳神經節(jié)切片中同時被FG與VIP或VAChT抗體標記的神經元胞體數(shù)量，并計算其占FG標記神經元總數(shù)的百分比（每個耳神經節(jié)組織制備6-9個切片）。

3.VIP和VAChT的免疫組化染色

1. 取出耳神經節(jié)和咬肌，浸泡于含30%蔗糖的冰冷緩沖液中，將兩者切成100μm切片，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，在含1%非免疫驢血清、0.3%曲拉通X-100和0.3%牛血清白蛋白的封閉液中孵育至少3小時。

2. 將切片置于含VIP抗體和VAChT抗體的封閉液中，4℃孵育2天；經磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，再置于含Alexa-488標記的驢抗兔IgG抗體和/或Alexa-568標記的驢抗山羊IgG抗體的封閉液中，4℃孵育1天。

3. 部分咬肌切片僅用VIP抗體和Alexa-568標記的驢抗兔IgG抗體進行免疫組化染色，染色后在4℃下與20mg/ml熒光素蓖麻凝集素I（RCA-I）孵育30分鐘（RCA-I為嚙齒動物血管壁標志物）。

4. 沖洗后將切片置于明膠包被玻片上，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察熒光；對照組實驗通過在孵育液中省略一抗或二抗進行。

4.咬肌血流量（MBF）測量

1. 大鼠吸入誘導麻醉后，腹腔注射烏拉坦維持麻醉，對股靜脈和股動脈進行插管，分別用于藥物注射和監(jiān)測全身動脈血壓（SABP）。

2. 對大鼠進行氣管插管，靜脈注射泮庫溴銨（初始劑量0.6mg/kg，之后每小時左右補充0.4mg/kg）使其麻痹，通過氣管插管給予50%空氣-50%氧氣混合氣體人工通氣，用加熱墊維持直腸溫度在37℃。

3. 實驗前切斷頸部雙側頸迷走神經和雙側頸上交感干，以排除迷走神經對心血管系統(tǒng)的反射作用及交感縮血管纖維對口面部的影響。

電刺激左側舌神經（LN）的中樞切斷端以誘發(fā)咬肌副交感神經反射性血管舒張，使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀監(jiān)測監(jiān)測并記錄咬肌血流量變化，通過血流儀圖表上的反應高度量化血流量變化（結果以任意單位表示）。

Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀

(A) 舌神經電刺激（對照組）以及靜脈注射不同劑量血管活性腸肽（VIP，1、10、100 ng/kg）后，局部血流量（MBF）升高的典型示例。

(B) 靜脈注射 0（僅生理鹽水）、1、10、100 ng/kg VIP 后，局部血流量（MBF）升高幅度的匯總統(tǒng)計（n = 4）。數(shù)據(jù)以舌神經電刺激（對照組）誘發(fā)反應的百分比表示。

(C) 在選擇性血管活性腸肽受體拮抗劑（[4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] - 血管活性腸肽）存在及缺失情況下，注射 100 ng/kg VIP 誘發(fā)局部血流量（MBF）升高的典型示例。

(D) [4 - 氯 - D - 苯丙氨酸?, 亮氨酸 1?] - 血管活性腸肽對 100 ng/kg VIP 誘發(fā)局部血流量（MBF）升高效應的影響，以用藥前反應的百分比表示（n = 5）。

5. 分別以0（僅生理鹽水）、1、10、100ng/kg劑量的VIP（溶于生理鹽水）經導管注射，觀察咬肌血流量變化；在注射VIP前20分鐘，持續(xù)注射0.1mg/ml的[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP（注射速度2ml/min），觀察其對VIP誘導的咬肌血流量變化的影響。

6. 分別在靜脈注射阿托品（0.1mg/kg）后、持續(xù)輸注[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP時、同時使用兩種藥物時，電刺激舌神經，將各處理后的數(shù)據(jù)以處理前（對照）反應的百分比表示。

5.統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（mean±SEM）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）結合雙側Dunnett檢驗或Tukey校正評估測試反應變化的統(tǒng)計學顯著性，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件（Windows系統(tǒng)）進行分析。

實驗結論

1. 支配大鼠咬肌血管的節(jié)后副交感神經中存在VIP免疫反應性，且VIP與囊泡乙酰膽堿轉運體（VAChT，膽堿能標志物）在耳神經節(jié)的FG標記神經元胞體及咬肌血管周圍的神經纖維上共定位。

2. 靜脈注射VIP可以劑量依賴方式誘導大鼠咬肌血管舒張，且不影響全身動脈血壓；選擇性VIP受體拮抗劑[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP能抑制VIP誘導的咬肌血管舒張，表明VIP可能通過激活咬肌血管壁上的VIP受體發(fā)揮血管舒張作用。

3. 單獨使用[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP無法抑制舌神經電刺激誘發(fā)的咬肌副交感神經血管舒張；單獨使用阿托品可使該血管舒張效應降低約36%；而當[4Cl-D-Phe6, Leu1?]VIP與阿托品聯(lián)合使用時，血管舒張效應降低約66%。這表明當毒蕈堿膽堿能受體被阿托品阻斷或乙酰膽堿（ACh）釋放受抑制時，VIP可能參與咬肌的副交感神經血管舒張調節(jié)。

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